宜春原油投资协会

第三部分 显微制片技术

枭阳学药人2019-01-13 13:53:30

第三部分     显微制片技术

     在进行显微鉴别时,首先要将“检样”制成适于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面的切片;对于粉末药材(包括丸、散等成方)可直接装片或作适当处理后制片。

²  永久片制作技术

²  临时制片技术

²  滑走切片机——半自动切片机

²  透射光生物学显微镜

²  连续变倍体视显微镜

²  变倍体视显微镜:是一种具有立体感觉的显微镜。

²  主要用途:作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、矿物学、考古学、地质学 和皮肤病学等的研究和解剖工具。

²  电脑(数码相机)型连续变倍体视显微镜

它观察物体时能产生正立的三维空间像,立体感强,成像清晰和宽阔,具有较长的工作距离,,并可根据观察物的特点选用不同的反射和透射光照明,是适用范围非常广泛的常规显微镜。对同一物体可实现连续放大倍率观看,可能直接电视机或电脑上观察实物图像。

偏光
显微镜

偏光
显微镜

倒置生物学显微镜

扫描电子显微镜

使用显微镜的注意事项

²  合理制片,盖玻片上不得有试液残留,避免污染物镜及载物台,损伤镜头。

²  转动物镜转换器,由低到高逐级变换、选用合适放大倍数的物镜观察。

²  使用40倍物镜时,可用细螺旋调节焦距,禁止用粗螺旋调节;也不得移动载玻片。

²  根据观察物象,选择偏光条件确认特征。

²  用毕,应将最小物镜与通光孔相对,关闭光源,罩好,收置起来。

²  显微镜的光学部分,只能用特殊的擦镜头纸擦拭。

1 常用制片法
   药材切片标本的制作方法较多。在药材鉴定的研究工作中往往将其制成石蜡切片(永久切片),因制成的石蜡切片外形较完整,厚薄均匀,且可制得连续切片,观察时方便,又能长期保存。但由于制片技术较复杂,费时太多,不适用于日常检验。

徒手切片或滑走切片法:

表面装片:为观察叶类、花类及全草类药材的叶片、花冠、萼片、苞片等的表皮组织及其附属物的特征。

解离组织装片:可清楚地观察比较坚硬的细胞组织,如导管、纤维、石细胞等的形态。

花粉粒与孢子制片法:观察花粉粒、孢子等的形态特征或构造,需用花粉粒与孢子制片法制片。

磨片法:观察矿物药或较坚硬的动物类药材如珍珠、石决明及动物骨骼,可采用磨片法制片。

仪器和用具

     仪器 

     用具
试液——封藏剂

3.l  水合氯醛试液  为常用封藏液,也是透化剂。可使干缩的细胞膨胀而透明,并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质、叶绿素及挥发油等,加热后更为明显。
3.2  甘油醋酸试液(斯氏液)  为常用封藏液,专用于观察淀粉形态,可使淀粉粒保持原形,便于测量其大小。
3.3  甘油-乙醇溶液  封藏液,也是软化剂。常用于保存植物性材料及临时切片,有软化组织的作用。
    ——染色剂

3.4  苏丹Ⅲ试液   此液可使木栓化、角质化细胞壁及脂肪油、挥发油、树脂等染成红色或淡红色。
3.5  钌红试液(临用新制)此液可使粘液染成红色。
3.6  间苯三酚试液  此液与浓盐酸合用,可使木化细胞壁染成红色或紫红色。
3.7  碘试液(临用现配。应置棕色瓶内保存)此液可使淀粉染成蓝色或紫色;蛋白质或糊粉粒染成棕色或黄棕色。

3.8  硝铬酸试液   此液为常用的“植物组织解离液”。各检品的解离浸泡时间,按材料的质地不同而异。

3.9  α-萘酚试液   此液可使菊糖染成紫红色,并很快溶解。
3.1l  氯化锌碘试液   此液用于检查木质化与纤维素细胞壁,前者显黄棕色,后者显蓝色或紫色。

显微标本的制作

4.1  横切制片或纵切制片
4.1.1  药材的预处理   将应观察的部位、切成适当大小的块或段,一般以宽lcm、长3cm为宜,切面削平整。质地软硬适中的样品可直接进行切片;质地坚硬的则需先使其软化后再切片。

制片的预处理——软化

  软化方法可采用放在吸湿器中闷润,或在水中浸软或煮软。经软化处理的材料,检查软化是否合适,可用刀片切割材料,若较容易切下薄片,则表示软化适宜。有些根、根茎、茎及木类药材,质地较坚实,可将削平的切面浸水中片刻,待表面润湿时取出,直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的样品,可将其浸入70%~95%乙醇中,约20分钟后可变硬些,再切片。

制片的预处理——禁忌

    药材预处理时,应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖、粘液等在软化、切片、装片等过程中,均不可与水接触,以免溶解消失;要观察挥发油、树脂等,则不可与高浓度乙醇或其它有机溶媒接触。

如:茯苓菌丝团块  淀粉粒  菊糖

4.1.2 切片

在检验工作中,此法最常用,操作简便,迅速,制成的切片保持其细胞内含物的固有形态,便于进行各种显微化学反应观察

4.1.2.1 徒手切片法切片

    一手持刀片,另一手拇指和食指夹持样品,中指托着样品的底部,使样品略高出食、拇二指;肘关节应固定,使样品的切面保持水平,刀口向内并使刀刃自前向后切削,即可得薄切片。

    操作时,材料的切面和刀刃须经常加水或50%乙醇保持湿润,防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50%乙醇的培养皿中。

4.1.2.2 滑走切片机切片

此法不需要较高的技巧,只要了解掌握操作方法,短时间内即可学会并切出较薄的切片,适用于切质地坚实、形状较大的药材样品,柔软的样品经冷冻处理亦可切得较薄的切片。
切片前:

    应检查切片机是否稳固,并调试刀具。将切片刀夹持在夹刀器上夹紧,调整刀的角度(0~15);调整厚度调节器至所需厚度。把制备好的样品用两块软木夹住或直接放在切片机的材料固定器上夹紧夹正,使样品露出软木块或固定器上端0.5cm,调整好样品高度,使刀刃靠近样品的切面且平行并略高于刀刃约0.5~1mm

切片时

    用右手握夹刀器柄,往操作者方向迅速拉动,切下的切片附着于刀的表面上,用毛笔蘸水把切片取下放于盛水的培养皿中。将刀推回原处,转动厚度推进器,用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃,再拉刀柄,往返推拉,可得到许多厚度均匀完整的切片。若切片不成功,应检查切片刀是否太钝,则应磨刀或换锋锐的切片刀,若切得太薄而破碎,则逐渐增加厚度至能切得完整的薄片为度。注意:夹持在材料固定器上的样品切面接近于固定器上端时,必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。

4.1.2.3 装片

  选取薄而平整的切片置载玻片上,根据所要观察的内容要求,滴加适宜的试液1~2滴,盖好盖玻片,即可在显微镜下观察。为防止较大的切片弯卷,可选取理想的切片,用两张载玻片夹住,浸于水中放置4小时使材料压平,放入95%乙醇中固定,甘油装片观察。

透化

   在载玻片上放有切片处滴加1~2滴水合氯醛试液,置载玻片于酒精灯上方微微加热,至边缘起小泡即停止加热,可继续补充试液再加热,以不烧干为度,直至切片透化完全为止。

注意:

   加热温度不能过高,以防水合氯醛试液沸腾,使组织内带入气泡;加热时应将载玻片不断移动,以免受热不匀而炸裂。透化后放冷,加甘油乙醇试液l~2滴后加封盖片,贴上标签。冬日室温较低时,透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液,以防水合氯醛结晶析出而妨碍观察。水合氯醛试液能使已收缩的细胞膨胀,便于清楚地观察组织构造;可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿体、树脂、挥发油等,对草酸钙结晶无作用,为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物质则加水合氯醛试液不加热。

4.2  粉末制片

   主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方制剂的观察。
4.2.l  药材粉末制备  取干燥药材,磨或锉成细粉(通常应过80目以上药筛),装瓶,贴上标签。制备粉末时,注意取样的代表性。例如:根类药材要切取根头、根中段及根尾等部位,并全部磨粉,过4号筛,混合均匀,不得丢弃渣头。干燥时,一般温度不能超过60℃,避免淀粉粒糊化,有碍观察。

4.2.2 粉末制片法

   用解剖针挑取样品粉末少许,置载玻片的中央,加适宜的试液1滴,用针搅匀(如为酸或碱时应用细玻棒代替针),待液体渗入粉末后,用左手食指与拇指夹持盖玻片的边缘,使其左侧与药液层左侧接触,再用右手持小镊子或解剖针托住盖玻片的右侧,轻轻下放,则液体逐渐扩延充满盖玻片下方。如液体未充满盖玻片,应从空隙相对边缘滴加液体,以防产生气泡;若液体过多,用滤纸片吸去溢出的液体,最后在载玻片的左端贴上标签或书写上标记。

显微化学分析

   丁香切片滴加3%氢氧化钠的氯化钠饱和液,油室内有针状丁香酚钠结晶析出;北柴胡横切片加无水乙醇-浓硫酸11液,木栓层、栓内层和皮层显黄绿色至蓝绿色。

微量升华法

   利用药材所含成分有升华现象,置显微镜下观察结晶形状、色泽。如大黄,可见菱状针状或羽状结晶。

4.2.3 成方制剂粉末装片 

    按剂型不同,分别处理样品,按粉末制片法装片观察。

4.2.3.1 散剂、胶囊剂

    可直接取出粉末(内容物为颗粒状的应研细)装片,或透化装片。

4.2.3.2 片剂

   可取2~3片,水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等(有包衣者除去包衣)取数丸或1~2锭,置于乳钵中研细,取出适量粉末装片,或透化装片。
4.2.3.3  蜜丸剂

样品可用两种方法处理:(1)用解剖刀沿蜜丸正中切开,从切面由外至内刮取少许样品,置载玻片中央,滴加适宜的试液,用玻璃棒搅匀。按上述粉末制片法装片,或透化装片。(2)将样品切碎放入容器,加水搅拌洗涤,然后置离心管中离心、沉淀。也可置超声仪中处理少时,以助样品分散。如此反复以除尽蜂蜜后,取沉淀或透化后装片。

4.2.4 粉末制片的注意事项
4.2.4.1  粉末药材制片时,每片取用量宜少不宜多,为使观察全面,可多做些制片。如取量多,显微特征单一轮廓不清,反而费时,不易得出准确结论。成方制剂的粉末检查,是在多味药材粉末中寻找某一味药的某一显微特征,有时较难查见,可以取粉末适量,置试管或小烧杯中,加水合氯醛液透化(加适量甘油以防水合氯醛结晶析出),搅匀,用吸管吸取混悬液装片,观察。
4.2.4.2  粉末样品如用水或稀甘油装片时,可先加少量乙醇使其润湿,以避免或减少气泡的形成,或反复将盖玻片沿一侧轻抬,亦可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出。
4.2.4.3  装片用的液体易挥发,装片后应立即观察。用水装片也较易蒸发而干涸,通常滴加少许甘油可延长保存时间。

4.3  表面制片 

   主要用于叶类、花类(萼片、花瓣)、果实类、草质茎及鳞茎类等药材的表面特征如毛茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地菲薄的药材可以整体装片;较厚的药材则需撕下表皮装片。
4.3.1  整体装片  适用于较薄的叶片、萼片和花瓣。剪取欲观察部位约4mm2的两小片,一反一正放在载玻片上,加水合氯醛试液加热透化,补充封藏液,盖好玻片即得。
4.3.2  表皮撕离装片

   适用于较厚的或新鲜药材不便于整体装片的样品。将软化了的或新鲜材料固定住,然后用镊子夹住要剥取撕离的部分,小心的撕离,或用解剖刀轻轻割()去不需要的各层组织,只保留表皮层(上层或下层),将欲观察的表皮表面观朝上,置载玻片上,加水合氯醛试液加热透化,补充封藏液,盖好玻片即得。

4.4  解离组织片

   适用于厚壁组织或输导组织等的单个细胞的显微观察。将样品切成段(长约5 mm,粗约2 mm)或片(厚约l mm),观察纤维或导管等最好切成纵长的小段。然后根据细胞壁的性质,按照下列方法之一进行处理:对于薄壁组织占大部分,木化组织少或分散存在的样品,可用氢氧化钾法;如样品坚硬,木化组织较多或集成较大群束的样品,可用硝铬酸法或氯酸钾法。

4.4.1 氢氧化钾法

   置样品于试管中,加5%氢氧化钾溶液适量,加热至用玻璃棒挤压,能离散为止,倾去碱液,加水洗涤后,取出少量置载玻片上,用解剖针撕开,以稀甘油装片观察。
4.4.2  硝铬酸法

   置样品于小烧杯中,加硝铬酸试液(20%硝酸与20%铬酸的等量混合液)适量,使之浸没样品,放置约30~60分钟。坚硬的样品需时要长些,也可在水浴上微温,至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,用水洗涤后,照氢氧化钾法操作装片。

4.4.3 氯酸钾法

  置样品于试管中,加硝酸溶液(12) 及氯酸钾少量,缓缓加热,待产生的气泡渐少时,再及时加入氯酸钾少量以维持气泡持续地发生,至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,用水洗涤后,照氢氧化钾法操作装片。
4.4.4  注意事项

   用氯酸钾法制片时,每次加入的氯酸钾不可过多,加热温度不宜过高,否则突沸容易使液体逸出管外。加热时间长短因样品的硬度和木化程度而异,通常约需5~15分钟。操作过程中产生的氯气有毒,应注意通风。
   用硝铬酸法解离也可在载玻片上进行。即取一块厚度适当的样品,置载玻片上,滴加硝铬酸试液使之浸没,放置约20分钟后,轻轻压下或移动盖玻片使之分离。其余操作同前,此法解离的细胞,可以看清其分离的组织部位。

4.5  花粉粒与孢子制片

  取花粉、花药(或小的花)或孢子囊群(干燥样品浸于冰醋酸中软化),用玻璃棒捣碎,纱布过滤,滤液置离心管中,离心,取沉淀加新鲜配制的醋酐与硫酸(91)的混合液l~3mL,置水浴上加热2~3分钟,离心,取沉淀,用水洗涤2次,可直接用水合氯醛试液装片,具体操作同粉末标本片。也可加50%甘油与1%苯酚34滴,用品红甘油胶封藏观察。

4.6  磨片

    凡需观察断面,以一般切片法又无法制作的标本,如坚硬的动物类药材珍珠、石决明、动物骨骼、矿物药等可采用磨片法制片。片的厚度一般为20~50μm。磨片方法有手工磨制与机器磨制。
     手工磨制 

     机器磨制

显微测量

  显微鉴定时用于测量细胞及细胞内含物等大小的方法最多的是长度测量。常用的量具是目镜测微尺和载物台测微尺。
5.1  目镜测微尺又称目镜量尺或目微尺。是放在目镜内的一种标尺,为一个直径18~20mm的圆形玻璃片,中央刻有精确等距离的平行线刻度。
目镜测微尺是用以直接测量物体用的,使用前必须用载物台测微尺来标定。
5.2  载物台测微尺又称镜台测微尺或台微尺。为一种特制的载玻片,中央粘有一小圆形玻片,上刻有将lmm精确等分为100小格的细线,每一小格长为10μm,用以标定目镜测微尺。

5.4  细胞及其内含物的测量方法

   将欲测目的物的显微制片置显微镜载物台上,对光,调焦,移动载片,使需测量的目的物置于目镜量尺范围内,调清物象,用目镜测微尺测量目的物的小格数,乘以上述每一小格相当的长度(μm),即得。

5.5  显微测量注意事项

5.5.1 通常在高倍镜下进行测量,结果较为准确。但欲测量较长的目的物为纤维、导管、非腺毛等,在低倍镜下测量较为方便。

 5.5  显微测量注意事项

5.5.2 应记录每次测量数据,并分析数据的最小量值、最大量值和多见量值(μm)。如浙贝母粉粒直径为有少量略高于或低于规定的数值。6~56μm,表示最小量值和最大量值;如为6~40~56μm,中间的数值表示多见量值。测量直径时,应以物体中部为准。

 5.5.3  测量时,如大小与规定有差异时,允许有少数低于或超出规定范围的数值。

显微鉴别法注意事项

6.1  粉碎用具用毕后,必须处理干净并干燥后才能用于另一种药材的粉碎。
6.2  所用盖玻片和载玻片应保持洁净。新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时以上;用流水冲洗后,再用蒸馏水冲洗1~2次,最后浸置于70%~90%乙醇中,备用。
6.3  进行显微鉴别时,一般先以甘油醋酸封片观察,然后以水合氯醛封片观察,最后再加热透化或滴加其它理化试剂进行显微观察。所以在实验中,首先应观察淀粉粒、菊糖等,不论其多少和大小,均应作记录;其次方是其它的显微特征。

6.4  应借助偏光装置寻找和观察显微标本,尤其是淀粉粒、结晶物,纤维、石细胞、导管等特征。
6.5  为提高显微鉴别的正确性,可以对照药材或已经鉴定品种的药材为对照观察。
6.6  成方制剂鉴别前,应了解处方组成和制法,分析处方中各种药材的主要鉴别特征及其量的多少,进行显微鉴别时,应观察3~5张以上装片,使特征不致遗漏。

记录——详细、清晰、明确、真实

7.1  组织特征的记录,应以从外至内的次序进行,对有鉴别意义的特征需详细地描述;一般应绘制简图。必要时,应利用显微描绘器或显微摄影装置绘制详图或提供显微照片,并注明放大倍数,或加比例尺。

7.2  粉末显微鉴别时,先记录原粉末的色泽、气味。然后边观察、边记录。注意观察的全面性。观察每张粉末片时,应自上左至下右,呈“之”字形扫描,逐渐移动装片,全面观察目的物,描述其特征,测量其长度,并注意统计最小量值、多见量值、最大量值。一一记录。通常以先多数后少数的顺序观察与描述特征,加注“多见”、“少见”、“偶见”等字样。注意着重描述有鉴别意义的组织、细胞和含有物,对于各类药材均具有的一些基本组织,如叶类药材有栅栏细胞、海绵细胞、细小导管等可不作重点描述。
7.3  应注意标准规定以外的异常显微特征的记录,并根据药材的基原、成方制剂的处方和制法综合分析,必要时可以对照药材或已经鉴定品种的药材为对照进行判断。

结论

    根据观察、记录的检品显微特征与标准规定内容或对照药材比较是否相符,断定其真伪或是否有掺伪,甚至成方制剂投料的真实性。